Ensayo ABTS
Este es un método analítico que utiliza una medición espectrofotométrica para determinar la capacidad antioxidante de una muestra. Se usa un espectrofotómetro UV-Vis para medir la absorbancia de una solución que contiene el radical ABTS • +, generado por la oxidación del ABST (2, 2'-azinobis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato), una sustancia incolora que se presenta en la forma radical se colorea absorbiendo las longitudes de onda características en el rango visible. La adición de moléculas antioxidantes a la solución ABTS • +, que puede actuar a través de hidrógeno y una transferencia de electrones, determina la reducción del radical a la forma incolora, con la consiguiente decoloración de la mezcla de reacción. Esta decoloración, proporcional a la cantidad de antioxidante presente, se puede medir como una disminución de la absorbancia en un cierto tiempo a una longitud de onda específica (734 nm). El poder antioxidante se expresa en comparación con los valores de absorbancia medidos para cantidades conocidas de una molécula antioxidante elegida como estándar de referencia, que generalmente es ácido ascórbico o Trolox (en este caso se habla de la actividad antioxidante de la capacidad antioxidante equivalente TEAC Trolox).
La medición del poder antioxidante basada en el uso del ABTS tiene la ventaja de ser simple y rápida. Además, permite la medición de antioxidantes tanto hidrófilos como lipófilos en un amplio rango de pH. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el radical usado (ABTS • +) no es fisiológico y no está presente en los sistemas biológicos y que a menudo se destacan los problemas de repetibilidad de la medición debido a la cinética de reacción de los diferentes antioxidantes involucrados.
FRAP (poder reductor de antioxidantes férrico)
La prueba FRAP mide la capacidad reductora de los antioxidantes contra los iones de hierro. Es un método basado en la transferencia de electrones, en el que los iones de hierro pasan de Fe3 + a Fe2 +. Bajo ciertas condiciones de pH (3.6) y en presencia de TPTZ (2, 4, 6-tris (2-piridil) -s-triazina), estos iones forman complejos con características diferentes, en particular el derivado reducido (Fe2 +). -TPTZ) adquiere un color azul que tiene una absorción máxima a 593 nm que se puede medir espectrofotométricamente. Por lo tanto, la capacidad reductora de una sustancia antioxidante se puede medir como una variación en la absorbancia de la solución que contiene el oxidante en la longitud de onda establecida para la comparación con la variación relativa a un estándar (por ejemplo, ácido ascórbico).
La prueba FRAP se diseñó para medir el poder reductor del plasma, pero luego se adaptó para probar la capacidad antioxidante de compuestos puros y matrices complejas. De hecho, dado que este método permite evaluar solo la capacidad reductora mediante la transferencia de electrones, ignorando completamente la acción de los antioxidantes que actúan a través de la transferencia de hidrógeno, no permite medir la contribución de las moléculas, como los tioles y las proteínas, que desempeñan un papel antioxidante. fundamental en los fluidos biológicos (por ejemplo, la sangre). La ventaja de usar este método es que es uno de los métodos más simples, rápidos y económicos para determinar la capacidad antioxidante in vitro.
PRUEBA DPPH
El 2, 2-difenil-1-picrilidrazilo (DPPH •) es un radical nitrógeno muy estable y disponible comercialmente, caracterizado por un intenso color rojo-púrpura, que se decolora cuando se reduce en presencia de una molécula con capacidad antioxidante. Mediante la medición espectrofotométrica a 517 nm de la variación de absorbancia de la solución de DPPH después de la reacción con un compuesto antioxidante, es posible cuantificar la capacidad reductora de la sustancia de ensayo si actúa por transferencia de hidrógeno o por transferencia de electrones. El resultado se expresa generalmente como IC50, es decir, la cantidad de antioxidante capaz de reducir en un 50% la concentración inicial de DPPH.
Es un método rápido, sencillo y económico. Los límites de esta técnica analítica están dados por la posibilidad de que los resultados del análisis se falsifiquen en el caso en el que las moléculas de prueba absorben en el mismo rango de longitud de onda que el radical DPPH o en presencia de moléculas grandes gravadas estéricamente que no lo hacen. Reaccionan con la parte reactiva de la raíz. Esto determina que el DPPH reacciona con antioxidantes hasta 1000 veces más lento que los radicales peroxilo.
PRUEBA PCL (fotoquimioluminiscencia)
La prueba de PCL se basa en la reacción de una especie radical específica, el anión superóxido (O2 - -), generado fotoquímicamente por radiación UV, con un compuesto capaz de emitir quimioluminiscencia. El marcador utilizado es el luminol, una molécula que cuando se oxida con radicales libres emite una luz que se puede medir con un instrumento especial (Photochem®). La presencia de antioxidantes en la mezcla de raciones desactiva las especies radicales al inhibir la emisión de quimioluminiscencia. El análisis de PCL es muy rápido y sensible. Además, con la aplicación de dos protocolos analíticos diferentes, llamados ACW (Capacidad antioxidante soluble en agua) y ACL (Capacidad antioxidante soluble en lípidos), se pueden medir las contribuciones a la capacidad antioxidante total de ambos componentes solubles en agua (flavonoides, vitaminas) para el mismo compuesto. C, aminoácidos, etc.) la del liposoluble (tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides, etc.). Para la comparación de los valores registrados con las mediciones relativas a las moléculas de referencia estándar, ácido ascórbico para el protocolo ACL y Trolox para el protocolo ACW, se obtiene la capacidad antioxidante del producto de prueba.
